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关于实验中抗体的常见问题及解决方法

发布时间:2023-06-07   点击次数:82次

问题

原因

解决方案

边缘效应

组织边缘贴附不牢,边缘组织松脱漂浮于液体中

APES/多聚赖氨酸处理玻片;组织切片尽量??;尽量避免选用坏死较多的组织


试剂未充分覆盖组织

滴加试剂时让试剂完整覆盖组织

非特异性染色体

抗体质量问题

使用质量有保证的抗体


抗体孵育时间长

减少孵育时间


抗体浓度过高

降低抗体浓度


一抗为多抗

使用单克隆抗体


内源性过氧化物酶及biotin

延长灭活时间


封闭不足

延长封闭时间


DAB孵育时间过久或浓度过高

按说明书配置试剂,镜下控制反应时间


抗体孵育后洗涤不充分

每次孵育之后洗3*5次


滴加试剂时干片

及时滴加试剂


切片在缓冲液中浸泡过久

抗原修复之后及时封闭加一抗,不能过夜

阴性结果

抗体浓度及质量

选择有质量保证的抗体,先做预实验摸索抗体使用浓度


抗原修复不全

摸索合适的抗原修复方式及修复时间


抗原丰度

正常阴性


封闭时间过长

减少封闭时间


DAB孵育时间短

镜下控制显色时间


细胞通透不全,抗体未能进入细胞反应

选择合适的通透剂及其反应时间


一抗二抗不匹配

选择正确来源的二抗

脱片

玻片未处理好

玻片清洗干净后用APES或多聚赖氨酸处理


切片厚薄不均匀

更换刀片;调整好切片机状态


烤片时间或温度不够

60摄食度2小时


组织自身问题

肿瘤坏死组织及骨组织本身易脱片


抗原修复时温度迅速变化

抗原修复后让其自然冷却


操作时用力过猛

有脱片嫌疑的切片不要用力甩,用吸水纸吸干残余液体

染色弱

抗体浓度低,孵育时间短

提高抗体浓度,延长反应时间


试剂使用超过有效期

试剂定时更新


滴加试剂时残余缓冲液过多使试剂稀释

滴加试剂前尽量减少残余液体


封闭过度

减少封闭时间

着色不均匀

切片厚度不一致

更换刀片;调整好切片机状态


试剂配制未混匀使局部浓度不一致

试剂充分混匀后滴加


试剂未完整覆盖组织

滴加试剂时让试剂完整覆盖组织


脱蜡不完整

更换脱蜡剂或延长脱蜡时间


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